一般使用辣根過(guò)氧化物酶 HRP-ECL 發(fā)光法或堿性磷酸酶 AP-NBT/BICP 顯色法。

1．HRP-ECL 發(fā)光法：

將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶（5 min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中 1～2 min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定 Marker，進(jìn)行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP 顯色法：

每片 NBT/BICP 可溶解于 30 ml 水中，使用前將一片分裝在 30 個(gè) EP 管中，每張 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。將 PBST 或 TTBS 洗滌過(guò)的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線(xiàn)，顯色 20 s 后每 10 s 觀(guān)察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀(guān)察與掃描。

注：背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當(dāng)然如果暴光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半小時(shí)，出現(xiàn)背景是正常的。